Esta nueva ciudad, desligada definitivamente de Asunción, se convirtió en la nueva base para las expediciones que buscaban encontrar.
De esta forma Santa Cruz de la Sierra se convirtió en la capital de la Gobernación del mismo nombre y pasó a depender de la Audiencia de Charcas. Las naciones nativas que rodeaban la ciudad de Santa Cruz de la Sierra eran: los chiquitanos, los chirihuanos, los yuracarés y los chanés.
En 1809 se originaron en Santa Cruz las primeras sublevaciones de esclavos e indios por la independencia, las cuales se concretaron en el primer grito libertario de Santa Cruz, el 24 de septiembre de 1810, en el que también influyeron las sucesivas sublevaciones que se iniciaron en La Paz, Chuquisaca y Cochabamba. A la cabeza de este movimiento estuvieron los caudillos educados en la Universidad de San Francisco Xavier de Chuquisaca, quienes destituyen a Pedro Toledo Pimentel y organizaron una Junta Provisoria siguiendo el ejemplo de la Junta de Buenos Aires.
El levantamiento lo lideraron Antonio Vicente Seoane, el coronel Antonio Suárez, el cura José Andrés Salvatierra, Juan Manuel Lemoine y el argentino Eustaquio Moldes.
Posteriormente, uno de los caudillos, Ignacio Warnes, gobernó Santa Cruz desde 1813 hasta 1816, durante su gobierno liberó a los esclavos negros, con los que formó el batallón de los Pardos Libres. Continuó con la lucha por la independencia, uno de los combates más importantes que dirigió fue la batalla de Florida, el 25 de mayo de 1814, en la que Warnes y el coronel Manuel Álvarez de Arenales vencieron al realista Joaquín Blanco.
Warnes es recordado como prócer de la región cruceña, tras haber dirigido la batalla de El Pari en 1816 y hacer frente al ejército realista encabezado por el coronel Francisco Javier Aguilera. Lastimosamente en esta batalla cayó tras haber sido atravesado por un bayonetazo y cortada su cabeza que fue puesta en una picota con la que Aguilera ingresó triunfante a Santa Cruz.
La victoria realista de El Pari convirtió a Aguilera en el nuevo gobernador de Santa Cruz y con esto retornó la esclavitud, la violencia y muerte, ejecutó a todos los sospechosos de pertenecer a la patria; sin embargo, estuvo todo el tiempo asediado por José Manuel Mercado, colaborador de Ignacio Warnes, quien junto a otros, constantemente intentaban recuperar la plaza cruceña.
A pesar de varios intentos, Mercado no logró retomar Santa Cruz y por el contrario Aguilera afianzó su poder en toda la provincia, que incluía Moxos y Chiquitos. La noticia del triunfo patriota en Junín y Ayacucho permitió a Mercado tomar Santa Cruz y proclamar la independencia el 14 de febrero de 1825.
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